革兰氏染色基本步骤是：（1）涂片固定。（2）草酸铵结晶紫染1分钟。（3）蒸馏水冲洗。（4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。（5）水洗，用吸水纸吸去水分。（6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。（7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，蒸馏水冲洗。干燥，镜检。
染色原理：
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是因为一般认为革兰氏染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分进行染色的。
通过初染和媒染后，细胞内形成了不溶于水的结晶紫一碘大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上它基本不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在细胞壁内，使其呈现紫色。而革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大缝隙，复合物容易溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又成无色。这时再用红色染料进行复染，革兰氏阴性细菌将获得一层新的颜色--红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。
拓展：
革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）：大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，可以选择青霉素族，头孢曲松钠等。
革兰氏阴性菌，大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。
